Поиск анализа

№AN514ГИЭ, Цитологическое исследование (костный мозг)

Срок исполнения

5 рабочих дней (плюс 1-2 дня для регионов)

*указанный срок не включает день взятия биоматериала

Исследуемый материал

стекла с мазками костного мозга, костный мозг в пробирке с ЭДТА

Метод определения

цитологическое исследование после окрашивания

            

   Костный мозг является основополагающим местом гематопоэза у мелких домашних животных, процесс которого контролируются факторами роста и цитокинами и обеспечивается нормальной микросредой костного мозга. На продукцию клеточного состава крови влияет так же множество факторов, включая гормональные, физиологические и метаболические аспекты жизни пациента, поэтому ряд изменений в его статусе может спровоцировать те или иные состояния костного мозга, отражающиеся непосредственно на картине периферической крови животного. Таким образом, воспалительные реакции, к примеру, вызывают вполне закономерную гиперплазию гранулоцитарного ростка. Анемии, в свою очередь, в зависимости от наличия или отсутствия регенеративного ответа, могут сопровождаться гиперплазией или гипоплазией эритроидного ростка, в зависимости от вызывающих их факторов. Так же в самом костном мозге могут развиваться патологические процессы, непосредственно влияющие на его работу, включающие неопластические, иммуноопосредованные и идиопатические механизмы.

   Бесспорными показаниями к цитологическому исследованию костного мозга являются гематологические нарушения, проявляющиеся в цитопениях одного, а особенно нескольких ростков без явной подлежащей причины, а также наличие циркулирующих в периферической крови клеток с ненормальной морфологией. Однако, при анемии с наличием регенеративного ответа исследование костного мозга абсолютно не показано, равно как и в случаях нерегенеративной анемии, когда причина кроется в механизмах, заключенных вне костного мозга (анемия хронического заболевания, хроническая болезнь почек, эндокринопатии). Так же показаниями к взятию костного мозга могут быть персистирующие повышения клеток периферической крови той или иной линии без подлежащей причины (нейтрофильный сдвиг влево без наличия воспаления, выраженный тромбоцитоз с наличием макротромбоцитов или тромбоцитов с ненормальной морфологией), правда, нередко при исследовании материала от таких животных можно наблюдать просто выраженную гиперплазию того или иного ростка, не говорящие об однозначной этиологии процесса, однако при исследовании костного мозга можно оценить диспластические изменения в той или иной линии клеток. Большое количество ядросодержащих эритроцитов без признаков полихромазии и ретикулоцитоза в совокупности с наличием большого количества незрелых гранулоцитов, циркулирующих в крови, относятся к лейкоэритробластозу и могут указывать на повреждение костного мозга, в том числе по причине неопластической инфильтрации. Исследование костного мозга часто позволяет поставить диагноз при подозрении на гематопоэтические новообразования, такие как миелоидные и лимфоидные лейкозы, плазмоцитарные опухоли (множественная миелома) или гистиоцитозы.

   Стадирование опухолевого процесса и оценка эффективности химиотерапии так же могут потребовать исследования костного мозга на наличие диссеминации первичной опухоли, что особенно актуально для мастоцитом и лимфом, хотя и другие новообразования могут давать метастазы в этот орган. Другие показания для аспирации материала из костного мозга включают гиперкальциемию и гиперпротеинемию и лихорадку невыясненного генеза, а также подозрение на инфицирование такими патогенами, как микобактериоз, лейшманиоз, цитозооноз и гистоплазмоз.

   В случаях с нерегенеративной иммуноопосредованной анемией с атакой на клетки-предшественники (PIMA) нахождение фагоцитоза эритроидных прекурсоров в костном мозге может дать ключ к постановке диагноза у пациента, особенно, при условии, что, не смотря на иммунологическую природу заболевания, тест Кумбса у половины таких животных будет отрицательным.

   При подозрениях на гематологические нарушения в следствии выраженных гипоплазий и аплазий одной или нескольких линий костного мозга цитологическое исследование может не дать полноценной картины ввиду очень малого количества полученных клеточных элементов. В этих состояниях целесообразным может быть взятие биоптатов из костного мозга с последующим гистологическим исследованием, которое позволяет более объективно оценить общую клеточность, а также в случаях с миелофиброзом, некрозом, желатиновой трансформацией и остеосклерозом визуализировать наличие этих нарушений и степень их распространения в костномозговой ткани.

   Также дополнительные методы окраски на гемосидерин в костном мозге позволяют оценить общее количество запасов железа в организме у собак (у кошек железо в костном мозге в норме отсутствует), однако эта оценка субъективна и должна проводиться с учетом возраста животного (у пожилых животных его количество повышается). Повышение количества железа в костном мозге может наблюдаться у животных с гемолитическими анемиями, дисэритропоэзом, анемии хронического заболевания по причине его секвестрации в макрофагах, а также после гемотрансфузий.

   Таким образом, цитологическое исследование костного мозга является неотъемлемым методом при широком спектре патологий, в особенности касающихся гематологических нарушений, которые на первом этапе можно зарегистрировать при рутинном исследовании клинической крови.

   Так как костный мозг напрямую отражает соотношение клеточных элементов в крови, критически важным условием при его исследовании является предоставление развернутого клинического анализа крови пациента с лейкоформулой, а желательно, и биохимического анализа, взятых в период не более 24 часов от взятия костного мозга. В противном случае интерпретировать миелоидно/эритроидное соотношение будет крайне затруднительно и ценность исследования значительно снизится.

Сроки исполнения: до 4-х дней (плюс 1-2 дня для регионов).

Исследуемый аналит: стекла с мазками костного мозга, костный мозг в пробирке с ЭДТА.

Метод исследования: цитологическое исследование после окрашивания.

Подготовка пациента: специальная подготовка не требуется. В случае, если предполагается седация, животное в день взятия биоматериала не кормить. Шерсть на месте предполагаемой пункции выстричь, поверхность кожи обработать антисептическим средством.

Показания:

  • цитозы неясного генеза (лейкоцитоз, тромбоцитоз, полицитемия);
  • выявление в мазке крови клеток с атипичной морфологией и клеток, отсутствующих в норме (бластные клетки, гранулярные лимфоциты, мастоциты и т.д.);
  • гипертермия неясного генеза;
  • гиперкальциемия, гиперпротеинемия;
  • точное стадирование опухолевых заболеваний (лимфом, мастоцитом);
  • диагностика лимфо-/миелолейкозов и других опухолей, в т.ч. метастазирования солидных опухолей в ККМ;
  • оценка запасов железа (железо сыворотки, ферритин, общая железосвязывающая способность сыворотки для животных малоспецифичны).

Противопоказания:  

  • противопоказания для общей/местной анестезии;
  • у животных с выраженной тромбоцитопенией случаются кровотечения, но они не драматичны (купируются наложением давящей повязки и льда),
  • описаны единичные случаи инфицирования по месту взятия;
  • имплантационные метастазы по тракту иглы в ходе пункции ККМ не описаны.

Нет оснований брать костный мозг у животных с регенеративной анемией без сопутствующих признаков, требующих оценки костного мозга в отношении сочетанной патологии.

Метод отбора: взятия материала из костного мозга на цитологическое исследование требует некоторых навыков и выполняется с применением разных методик. Как правило, пациенту нужна седация, соответственно нужно учитывать анестезиологические риски. Отбор эффективно производить из проксимальной части плечевой кости или проксимального эпифиза бедренной кости.

Необходимые инструменты:

- трепаны для костной ткани (можно использовать как для взятия ККМ, так и для получения образца самой кости, напр., при подозрении на остеосаркому)

- иглы типа Розенталь, Ямшиди, Иллинойс (толщина 16G-18G, для крупных собак 11G)

- стерильный шприц 5-20 мл (обычно 10 мл)

- пробирка с ЭДТА

- серологическая или автоматическая пипетка

- чашка Петри

- чистые сухие стекла (минимум 10 шт.) 

Способ № 1:

·         асептическая подготовка места вкола (выбрить шерсть, обработать спиртом);

·         дополнительно местно обезболить, несмотря на уже имеющуюся общую/местную анестезию (1% лидокаин, 2% новокаин), послойно («лимонная корка»), включая надкостницу;

·         выждать 1-2 мин.;

·         небольшой надрез кожи 1 см.;

·         ввести иглу до надкостницы, далее крутить до провала, т.е. до прохода иглы через кортикальный слой кости;

·         подсоединить шприц к игле и насосать ККМ (примерно 1 мл, больше не стоит, чем сильнее насасывать, тем больше гемодилюция);

·         СРАЗУ перелить пунктат в пробирку с ЭДТА, хорошо перемешать; 

·         из пробирки с ЭДТА перелить в чистую чашку Петри, наклонить чашку на 45-60 градусов (при этом происходит сепарация материала: жидкая кровь стекает вниз, комочки костного мозга и жира задерживаются в верхней части).

·         подцепить комочек пипеткой (напр., пастеровской), перенести его на чистое предметное стекло, накрыть сверху вторым предметным стеклом, растянуть стекла в разные стороны (180 градусов), при этом комочек как бы растирается между ними (такая методика называется «сквош»);

·         мазок должен быть тонким монослойным, но слишком сильно давить тоже нельзя, клетки могут разрушиться; готовый мазок хорошо высушить на воздухе и подготовить к отправке в лабораторию;

·         лучше сделать 8-10 мазков из разных комочков;

·         если в наклоненной чашке Петри комочки не обнаруживаются, то пункция неудачна (вы набрали только кровь), придется повторить отбор

Способ №2.

·         асептическая подготовка места вкола (выбрить шерсть, обработать спиртом);

·         дополнительно местно обезболить, несмотря на уже имеющуюся общую/местную анестезию (1% лидокаин, 2% новокаин), послойно («лимонная корка»), включая надкостницу;

·         выждать 1-2 мин.;

·         приготовьте стекла: поставьте их в штатив вертикально. Это нужно, чтобы избыток крови стекал вниз, в то время как костный мозг, который выглядит, как жир, оставался наверху стекла.

·         сделайте небольшой надрез кожи 1 см.;

·         введите иглу до надкостницы, далее крутить до провала, т.е. до прохода иглы через кортикальный слой кости;

·         подсоедините шприц к игле и насосите ККМ (до появления первой капли (важно!), чем сильнее насасывать, тем больше гемодилюция);

·         далее набранный материал быстро наносят на поставленные в штатив вертикально стекла. Избыток крови стекает вниз, в то время как ассистент или врач вторым стеклом растягивает препарат (выглядит, как жир), который не стекает, а остается наверху стекла;

·         растягивать препарат надо очень быстро, чтобы он не свернулся.

Преаналитика: ВАЖНО! 

Необходимо прикрепить к направительному бланку результат общеклинического исследования крови, взятого одновременно с костным мозгом (допускается результат ОКА, взятого в течение 1 дня до или 1 дня после взятия костного мозга), а также исследования на ретикулоциты, если проводилось. Если общеклиническое исследование крови не проводилось в день взятия костного мозга, необходимо прислать периферическую кровь в пробирке с сиреневой/ розовой крышкой (ЭДТА). Порядок манипуляций как для теста AN5. Оформить на отдельном бланке.

Порядок действий:

·         Взятие биоматериала согласно рекомендациям выше с соблюдением правил асептики/антисептики.

·         Приготовить 8-10 мазков костного мозга, подписать (вид, кличка животного, фамилия владельца), дать высохнуть, поместить в транспортный контейнер). Остатки костного мозга поместить в пробирку с ЭДТА, подписать «КМ», вид, кличку животного.

·         Одновременно с взятием костного мозга взять кровь в пробирку с ЭДТА, как для теста AN 5. Без венозной крови материал в работу не принимается! Сохранность образца 5 дней, пробирка с ЭДТА 3 дня. До отправки в лабораторию мазки хранить при +20°С…+25°С, цельная кровь +2°С...+8°С.

·         Заполнить все графы направительного бланка с ОБЕИХ сторон!

Температурный режим транспортировки в лабораторию +2°С…+8°С (синий пакет).

Интерпретация:

Диапазон нормальных значений.

·         Насыщенность клетками (в зависимости от возраста пациента): 25-75% кроветворных клеток, оставшаяся доля приходится на клетки жировой ткани.

·         Мегакариоциты: 2-7 в поле зрения при большом увеличении, причем их количество варьирует значительно; однако, их истинное количество может варьировать в широких пределах в зависимости от метода приготовления препарата.

·         Соотношение М/Э: 0,75-2,53 (у собак) и 1,21-2,16 (у кошек).

Возможные патологические изменения: 

·         Повышенное количество железа в костном мозге (интерпретируется в зависимости от возраста) - гемолиз, предшествующее переливание крови, анемия при воспалительном заболевании, парентеральное введение железа.

Высокие значения (гиперплазия):

         I.            Общая насыщенность клетками - пролиферативная реакция на стимуляцию с периферических отделов, анемия и/или гипоксемия (эритроидная гиперплазия); воспалительный процесс (гранулоцитраная гиперплазия); тромбоцитопения нецентрального генеза (мегакариоцитраная гиперплазия); неоплазия (первичная или метастатическая), острые и хронические лейкозы, лимфома (v) стадия; злокачественный гистиоцитоз; мастоцитоз.

       II.            Эритроциты - эффективная эритроидная гиперплазия в ответ на анемию и/или гипоксемию (чаще состояния гемолиза, кровопотери), полицитемия, реакция на лечение эритропоэтином; неэффективная эритроидная гиперплазия - дефицит фолатов, выраженный дефицит железа, наследственное нарушение метаболизма В12, некоторые миелопролиферативные и миелодиспластические нарушения, врожденный дисэритропоэз, иммуноопосредованная гемолитическая анемия при атаке на эритроидные предшественники в костном мозге.

     III.            Нейтрофилы - эффективная гранулоцитарная гиперплазия как пролиферативная реакция чаще в ответ на бактериальное воспаление, а так же иммуноопосредованный процесс, некроз, у собак с дефицитом адгезивных молекул β2–интегрина, у серых колли с циклическим гематопоэзом, ранняя токсичность эстрогена (с сопутствующей эритроидной и мегакариоцитраной аплазией), паранеопластическая нейтрофилия, хронический миелоидный лейкоз, реакция на лечение ГКСФ; неэффективная гранулоцитарная гиперплазия - миелодиспластические нарушения, кошки с нейтропенией, инфицированные ВЛК и/или ВИК, иммуноопосредованная нейтропения с атакой на зрелые клетки, собаки, получающие противосудорожные препараты, у которых присутствует периферическая нейтропения, инфекционный процесс в костном мозге.

    IV.            Эозинофилы - паразитарное заболевание (особенно заражение нематодами в период миграции и трематодами), воспалительный процесс в органах, богатых тучными клетками (кожа, легкие, кишечник, матка), IgE-опосредованные аллергические реакции гиперчувствительности (блошиная инвазия, астма кошек, эозинофильная бронхопневмония собак), эозинофильная гранулема, гиперэозинофильный синдром, эозинофильный лейкоз, миелодиспластические нарушения, опухоль из тучных клеток и реже другие опухоли (паранеопластическая эозинофилия).

      V.            Базофилы – обычно наблюдается при тех же нарушениях, которые приводят к эозинофилии, дирофиляриоз (у собак и кошек), базофильный лейкоз, миелодиспластические нарушения.


       VI.            Мегакариоциты - первичная и вторичная иммуноопосредованная тромбоцитопения, текущая внутрисосудистая коагуляция, гиперспленизм, повреждение сосудов, инфекции (например, ранняя стадия паразитарного поражения Ehrlichia canis) и токсикозы, вызванные деструкцией тромбоцитов, тромбоцитопения потребления, железодефицитная анемия, эссенциальная тромбоцитемия.

Сниженное количество железа в костном мозге - абсолютный дефицит железа, отсутствие - норма у кошек.

Низкие значения (гипоплазия):

         I.            Общая насыщенность клетками – генерализованная гипоплазия/аплазия, влияние определенных антибиотиков (например, цефалоспоринов и пр.), экзогенные или эндогенные эстрогены (у собак и хорьков), влияние противосудорожных препаратов (например, фенобарбитала), влияние фенилбутазона (у собак) и гризеофульвина (у кошек), влияние тиацетарсамида, мелофенамовой кислоты, хинидина (возможная причина у собак), влияние альбендазола, химиотерапия, облучение, миелонекроз (может приводить к появлению дегенеративных клеточных элементов), миелофиброз, парвовирусная инфекция собак и кошек (гипоплазия эритроидных и миелоидных клеток), вирусный лейкоз кошек, тяжелое поражение при манифестации Erllichia canis, первичная иммуноопосредованная деструкция предшественников кроветворных клеток (напр., чистая эритроидная аплазия), идиопатическая.

       II.            Эритроциты - селективная эритроидная гипоплазия, у серых колли с циклическим гемопоэзом (с последующим развитием эритроидной гиперплазии), влияние хлорамфеникола (особенно у кошек), лимфолейкоз, иммуноопосредованная гипоплазия, затрагивающая ранние эритроидные клетки-предшественники, иммуноопосредованная гипоплазия, связанная с терапией рекомбинантным эритропоэтином, вирус лейкоза кошек (тип С), у собак с идиопатическим миелофиброзом, анемия при воспалительных заболеваниях (с сопутствующей гранулоцитарной гиперплазией), эндокринопатии (например, гипотиреоз и др. - обычно соотношение М/Э не увеличивается), хроническое заболевание почек (обычно соотношение М/Э не увеличивается).

     III.            Нейтрофилы – селективная нейтрофильная гипоплазия, влияние азатиоприна (у кошек), влияние гризеофульвина (при лечении кошек от дерматофитии, риск выше у кошек, инфицированных ВИК), введение рекомбинантного ГКСФ, взятого от животного другого вида, парвовирусная инфекция собак или кошек, циклический гемопоэз, индуцированный ВЛК, иммуноопосредованная гипоплазия (при атаке на ранние предшественники).

    IV.            Мегакариоциты - селективная мегакариоцитарная гипоплазия (нечастое явление), иммуноопосредованная, вызванная действием препаратов (гипоплазия обычно генерализованная, может наблюдаться и подавление только мегакариоцитарного ростка), влияние лекарственных веществ (меклофенамовой кислота, фенилбутазона, триметоприм – сульфадиазина).

Форма выдачи результата: бланк содержит описание цитологического состава материала костного мозга, оценку морфологии и последовательности созревания клеточных элементов, подсчет миелоидно/эритроидного соотношения, заключение и комментарий, в котором сопоставляется картина клинической крови и костного мозга на момент исследования и указываются вероятные причины того или иного состояния.

Список источников:

1) Veterinary Hematology, A Diagnostic Guide and Color Atlas, By John W. Harvey, DVM, PhD, DACVP, 234-318;

2) Bone marrow cytologic and histologic biopsies: indications, technique, and evaluation, Raskin REMessick JB., Vet Clin North Am Small Anim Pract. 2012 Jan;42(1):23-42;

3) Collection and evaluation of bone marrow aspirates and core biopsies from dogs, COSMIN PEŞTEAN, ADRIAN TODOR, OANA FLORESCU and others, Annals of R.S.C.B., Vol. XXII, Issue 1, 2017, pp. 44 – 48.

4) Ш.Ваден,Д.Нолл, Ф. Смит, Л.Тиллей. Полное руководство по лабораторным и инструментальным исследованиям собак и кошек.