Цитологическое исследование костного мозга (включает общий анализ крови (одновременно со взятием костного мозга взять пробу цельной крови))

Костный мозг является основополагающей локализацией гематопоэза у мелких домашних животных, процесс которого контролируются факторами роста и цитокинами и обеспечивается нормальной микросредой костного мозга. На продукцию клеточного состава крови также влияет множество факторов, включая гормональные, физиологические и метаболические особенности организма пациента, поэтому ряд изменений в его статусе может спровоцировать те или иные состояния костного мозга, отражающиеся непосредственно на картине периферической крови животного. Таким образом, воспалительные реакции, к примеру, вызывают вполне закономерную гиперплазию гранулоцитарного ростка. Анемии, в свою очередь, в зависимости от наличия или отсутствия регенеративного ответа, могут сопровождаться гиперплазией или гипоплазией эритроидного ростка, в зависимости от вызывающих их факторов. Также в самом костном мозге могут развиваться патологические процессы, непосредственно влияющие на его работу, включающие неопластические, иммуноопосредованные и идиопатические механизмы.

Показаниями к цитологическому исследованию костного мозга являются гематологические нарушения, проявляющиеся в цитопениях одного или нескольких ростков без явной подлежащей причины, а также наличие циркулирующих в периферической крови клеток с атипичной морфологией. Также показаниями к взятию костного мозга могут быть персистирующие повышения клеток периферической крови той или иной линии без подлежащей причины (нейтрофильный сдвиг влево без наличия воспаления, выраженный тромбоцитоз с наличием макротромбоцитов или тромбоцитов с атипичной морфологией), правда, нередко при исследовании материала от таких животных можно наблюдать выраженную гиперплазию того или иного ростка, не говорящие об однозначной этиологии процесса, однако при исследовании костного мозга можно оценить диспластические изменения в той или иной линии клеток.

При регенераторнм ответе исследование костного мозга не является целесообразным, как и в случаях нерегенераторных анемий, вызванных механизмами, не затрагивающими костный мозг (анемия хронического заболевания, хроническая болезнь почек, эндокринопатии). Большое количество ядросодержащих эритроцитов без признаков полихромазии и ретикулоцитоза в совокупности с наличием большого количества незрелых гранулоцитов, циркулирующих в крови, относятся к лейкоэритробластозу и могут указывать на повреждение костного мозга, в том числе по причине неопластической инфильтрации. Исследование костного мозга часто позволяет поставить диагноз при подозрении на гематопоэтические новообразования, такие как миелоидные и лимфоидные лейкозы, плазмоцитарные опухоли (множественная миелома) или гистиоцитозы.

Стадирование опухолевого процесса и оценка эффективности химиотерапии также могут потребовать исследования костного мозга на наличие диссеминации первичной опухоли, что особенно актуально для мастоцитом и лимфом. Другие показания для аспирации материала из костного мозга включают гиперкальциемию, гиперпротеинемию и лихорадку невыясненного генеза, а также подозрение на инфицирование такими патогенами, как микобактериоз, лейшманиоз, цитозооноз и гистоплазмоз.

В случаях с нерегенеративной иммуноопосредованной анемией с атакой на клетки-предшественники (PIMA) нахождение фагоцитоза эритроидных предшественников в костном мозге может дать ключ к постановке диагноза у пациента, особенно при условии, что, несмотря на иммунологическую природу заболевания, тест Кумбса у половины таких животных будет отрицательным.

При подозрениях на гематологические нарушения в следствии выраженных гипоплазий и аплазий одной или нескольких линий костного мозга цитологическое исследование может не дать полноценной картины ввиду очень малого количества полученных клеточных элементов. В этих состояниях целесообразным может быть взятие биоптатов из костного мозга с последующим гистологическим исследованием, которое позволяет более объективно оценить общий цитоз, а также в случаях с миелофиброзом, некрозом, желатиновой трансформацией и остеосклерозом визуализировать наличие этих нарушений и степень их распространения в костномозговой ткани.

Дополнительные методы окраски на гемосидерин в костном мозге позволяют оценить общее количество запасов железа в организме у собак (у кошек железо в костном мозге в норме отсутствует), однако эта оценка субъективна и должна проводиться с учетом возраста животного. Повышение количества железа в костном мозге может наблюдаться у животных с гемолитическими анемиями, дисэритропоэзом, анемиями хронических заболеваний по причине его секвестрации в макрофагах, а также после гемотрансфузий.

Таким образом, цитологическое исследование костного мозга является неотъемлемым методом при широком спектре патологий, в особенности касающихся гематологических нарушений, которые на первом этапе можно зарегистрировать при рутинном исследовании клинической крови.

Так как костный мозг напрямую отражает соотношение клеточных элементов в крови, критически важным условием при его исследовании является предоставление развернутого клинического анализа крови пациента с лейкоформулой, оценкой количества ретикулоцитов, и биохимического анализа (желательно), взятых в период не более 24 часов от взятия костного мозга. В противном случае интерпретировать миелоидно/эритроидное соотношение будет крайне затруднительно, ценность исследования значительно снизится.

Подготовка пациента: Специальная подготовка не требуется. В случае, если предполагается седация, животное в день взятия биоматериала не кормить. Шерсть на месте предполагаемой пункции выстричь, поверхность кожи обработать антисептическим средством.

Показания:

• цитозы неясного генеза (лейкоцитоз, тромбоцитоз, полицитемия);

• выявление в мазке крови клеток с атипичной морфологией и клеток, отсутствующих в норме (бластные клетки, гранулярные лимфоциты, мастоциты и т.д.);

• гипертермия неясного генеза;

• гиперкальциемия, гиперпротеинемия;

• точное стадирование опухолевых заболеваний (лимфом, мастоцитом);

• диагностика лимфо-/миелолейкозов и других опухолей, в т.ч. метастазирования солидных опухолей в ККМ;

• оценка запасов железа (железо сыворотки, ферритин, общая железосвязывающая способность сыворотки для животных малоспецифичны).

Противопоказания:

• противопоказания для общей/местной анестезии;

• у животных с выраженной тромбоцитопенией случаются кровотечения (купируются наложением давящей повязки и льда);

• описаны единичные случаи инфицирования по месту взятия;

• имплантационные метастазы по тракту иглы в ходе пункции ККМ не описаны.

Нет оснований брать костный мозг у животных с регенеративной анемией без сопутствующих признаков, требующих оценки костного мозга в отношении сочетанной патологии.

Метод отбора биоматериала:

Взятие материала из костного мозга на цитологическое исследование требует некоторых навыков и выполняется с применением различных методик. Как правило, пациенту необходима седация, соответственно, нужно учитывать анестезиологические риски. Отбор эффективно производить из проксимальной части плечевой кости или проксимального эпифиза бедренной кости.

Необходимые инструменты:

• трепаны для костной ткани (можно использовать как для взятия ККМ, так и для получения образца самой кости, напр., при подозрении на остеосаркому);

• иглы типа Розенталь, Ямшиди, Иллинойс (толщина 16G-18G, для крупных собак 11G);

• стерильный шприц 5-20 мл (обычно 10 мл);

• пробирка с ЭДТА;

• серологическая или автоматическая пипетка;

• чашка Петри;

• чистые сухие стекла (минимум 10 шт.).

Способ № 1:

• асептическая подготовка места вкола (выбрить шерсть, обработать спиртом);

• дополнительно местно обезболить, несмотря на уже имеющуюся общую/местную анестезию (1% лидокаин, 2% новокаин), послойно («лимонная корка»), включая надкостницу;

• выждать 1-2 мин.;

• выполнить небольшой надрез кожи около 1 см.;

• ввести иглу до надкостницы, далее крутить до провала, т.е. до прохода иглы через кортикальный слой кости;

• подсоединить шприц к игле и набрать ККМ (примерно 1 мл, не боле: чем сильнее насасывать, тем больше гемодилюция);

• СРАЗУ перелить пунктат в пробирку с ЭДТА, хорошо перемешать;

• из пробирки с ЭДТА перелить в чистую чашку Петри, наклонить чашку на 45-60 градусов (при этом происходит сепарация материала: жидкая кровь стекает вниз, комочки костного мозга и жира задерживаются в верхней части);

• подцепить комочек пипеткой (напр., пастеровской), перенести его на чистое предметное стекло, накрыть сверху вторым предметным стеклом, растянуть стекла в разные стороны (180 градусов), при этом комочек как бы растирается между ними (такая методика называется «сквош»);

• мазок должен быть тонким монослойным, следует избегать сильного давления, т.к. клетки могут разрушиться; готовый мазок хорошо высушить на воздухе и подготовить к отправке в лабораторию;

• лучше сделать 8-10 мазков из разных комочков;

• если в наклоненной чашке Петри комочки не обнаруживаются, то пункция неудачна (вы набрали только кровь), придется повторить отбор.

Способ №2:

• асептическая подготовка места вкола (выбрить шерсть, обработать спиртом);

• дополнительно местно обезболить, несмотря на уже имеющуюся общую/местную анестезию (1% лидокаин, 2% новокаин), послойно («лимонная корка»), включая надкостницу;

• выждать 1-2 мин.;

• приготовьте стекла: поставьте их в штатив вертикально. Это нужно, чтобы избыток крови стекал вниз, в то время как костный мозг, который выглядит, как жир, оставался наверху стекла;

• сделайте небольшой надрез кожи 1 см.;

•  введите иглу до надкостницы, далее крутить до провала, т.е. до прохода иглы через кортикальный слой кости;

• подсоедините шприц к игле и насосите ККМ (до появления первой капли (важно!), чем сильнее насасывать, тем больше гемодилюция);

• далее набранный материал быстро наносят на поставленные в штатив вертикально стекла. Избыток крови стекает вниз, в то время как ассистент или врач вторым стеклом растягивает препарат (выглядит, как жир), который не стекает, а остается наверху стекла;

• растягивать препарат надо очень быстро, чтобы он не свернулся.

Преаналитика:

Порядок действий:

1. Произвести процедуру взятия костного мозга с соблюдением правил асептики/антисептики.

2. Полученный материал поместить в контейнер с сиреневой крышкой / Калий ЭДТА.

3. Осторожно перевернуть пробирку 6-7 раз для перемешивания жидкости с антикоагулянтом сразу же после переливания, не допуская образования сгустков.

4. Приготовить 8-10 мазков костного мозга (лучше использовать материал, находящийся в шприце, мазки можно сделать в первую очередь, затем переместив полученный материал в пробирку).

5. Высушить мазки на воздухе в течение 15 минут.

6. Одновременно со взятием костного мозга взять пробу цельной крови в пробирку с сиреневой крышкой / Калий ЭДТА, как для теста AN5. Осторожно перевернуть пробирку 6-7 раз для перемешивания крови с антикоагулянтом, не допуская образования сгустков.

7. Подписать предметные стекла и обе пробирки с сиреневой крышкой (вид, кличка животного, фамилия владельца; на пробирках указать «Кровь» и «КМ») положить в маркированный транспортный контейнер.

8. Заполнить все поля лицевой стороны направительного бланка. С обратной стороны указать подробный анамнез (включая все проведенные исследования, дифференциальные диагнозы) или приложить выписку из истории болезни.

9. Хранение стекол до транспортировки +20°С…+25°С, температурный режим транспортировки пробирки и стекол +2…+8°С (синий пакет).

Интерпретация результата: Результаты исследования содержат информацию исключительно для врачей. Диагноз ставится на основании комплексной оценки различных показателей, дополнительных сведений и зависит от методов диагностики.

Диапазон нормальных значений:

• Насыщенность клетками (в зависимости от возраста пациента): 25-75% кроветворных клеток, оставшаяся доля приходится на клетки жировой ткани.

• Мегакариоциты: 2-7 в поле зрения при большом увеличении, причем их количество варьирует значительно; их истинное количество может варьировать в широких пределах в зависимости от метода приготовления препарата.

• Соотношение М/Э: 0,75-2,53 (у собак) и 1,21-2,16 (у кошек).

Возможные патологические изменения:

• Повышенное количество железа в костном мозге (интерпретируется в зависимости от возраста) – гемолиз, предшествующее переливание крови, анемия при воспалительном заболевании, парентеральное введение железа.

Высокие значения (гиперплазия):

• Общая насыщенность клетками – пролиферативная реакция на стимуляцию с периферических отделов, анемия и/или гипоксемия (эритроидная гиперплазия); воспалительный процесс (гранулоцитраная гиперплазия); тромбоцитопения нецентрального генеза (мегакариоцитраная гиперплазия); неоплазия (первичная или метастатическая), острые и хронические лейкозы, лимфома (v) стадия; злокачественный гистиоцитоз; мастоцитоз.
• Эритроциты – эффективная эритроидная гиперплазия в ответ на анемию и/или гипоксемию (чаще состояния гемолиза, кровопотери), полицитемия, ответ на введение эритропоэтина; неэффективная эритроидная гиперплазия – дефицит фолатов, выраженный дефицит железа, наследственное нарушение метаболизма В12, некоторые миелопролиферативные и миелодиспластические нарушения, врожденный дисэритропоэз, иммуноопосредованная гемолитическая анемия при атаке на эритроидные предшественники в костном мозге.
• Нейтрофилы – эффективная гранулоцитарная гиперплазия как пролиферативная реакция чаще в ответ на бактериальное воспаление, а также иммуноопосредованный процесс, некроз, у собак с дефицитом адгезивных молекул β2–интегрина, у серых колли с циклическим гематопоэзом, ранняя токсичность эстрогена (с сопутствующей эритроидной и мегакариоцитраной аплазией), паранеопластическая нейтрофилия, хронический миелоидный лейкоз, реакция на лечение ГКСФ; неэффективная гранулоцитарная гиперплазия – миелодиспластические нарушения, кошки с нейтропенией, инфицированные ВЛК и/или ВИК, иммуноопосредованная нейтропения с атакой на зрелые клетки, собаки, получающие противосудорожные препараты, у которых присутствует периферическая нейтропения, инфекционный процесс в костном мозге.
• Эозинофилы – паразитарное заболевание (особенно заражение нематодами и трематодами в период миграции), воспалительный процесс в органах, богатых тучными клетками (кожа, легкие, кишечник, матка), IgE-опосредованные аллергические реакции гиперчувствительности (блошиная инвазия, астма кошек, эозинофильная бронхопневмония собак), эозинофильная гранулема, гиперэозинофильный синдром, эозинофильный лейкоз, миелодиспластические нарушения, опухоль из тучных клеток и реже другие опухоли (паранеопластическая эозинофилия).
• Базофилы – обычно наблюдается при тех же нарушениях, которые приводят к эозинофилии, дирофиляриоз (у собак и кошек), базофильный лейкоз, миелодиспластические нарушения.
• Мегакариоциты – первичная и вторичная иммуноопосредованная тромбоцитопения, текущая внутрисосудистая коагуляция, гиперспленизм, повреждение сосудов, инфекции (например, ранняя стадия паразитарного поражения Ehrlichia canis) и токсикозы, вызванные деструкцией тромбоцитов, тромбоцитопения потребления, железодефицитная анемия, эссенциальная тромбоцитемия.
• Сниженное количество железа в костном мозге – абсолютный дефицит железа, отсутствие – норма у кошек.

Низкие значения (гипоплазия):

• Общая насыщенность клетками – генерализованная гипоплазия/аплазия, влияние определенных антибиотиков (например, цефалоспоринов и пр.), экзогенные или эндогенные эстрогены (у собак и хорьков), влияние противосудорожных препаратов (например, фенобарбитала), влияние фенилбутазона (у собак) и гризеофульвина (у кошек), влияние тиацетарсамида, мелофенамовой кислоты, хинидина (возможная причина у собак), влияние альбендазола, химиотерапия, облучение, миелонекроз (может приводить к появлению дегенеративных клеточных элементов), миелофиброз, парвовирусная инфекция собак и кошек (гипоплазия эритроидных и миелоидных клеток), вирусный лейкоз кошек, тяжелое поражение при манифестации Erllichia canis, первичная иммуноопосредованная деструкция предшественников кроветворных клеток (напр., чистая эритроидная аплазия), идиопатическая.
• Эритроциты – селективная эритроидная гипоплазия, у серых колли с циклическим гемопоэзом (с последующим развитием эритроидной гиперплазии), влияние хлорамфеникола (особенно у кошек), лимфолейкоз, иммуноопосредованная гипоплазия, затрагивающая ранние эритроидные клетки-предшественники, иммуноопосредованная гипоплазия, связанная с терапией рекомбинантным эритропоэтином, вирус лейкоза кошек (тип С), у собак с идиопатическим миелофиброзом, анемия при воспалительных заболеваниях (с сопутствующей гранулоцитарной гиперплазией), эндокринопатии (например, гипотиреоз и др. – обычно соотношение М/Э не увеличивается), хроническое заболевание почек (обычно соотношение М/Э не увеличивается).
• Нейтрофилы – селективная нейтрофильная гипоплазия, влияние азатиоприна (у кошек), влияние гризеофульвина (при лечении кошек от дерматофитии, риск выше у кошек, инфицированных ВИК), введение рекомбинантного ГКСФ, взятого от животного другого вида, парвовирусная инфекция собак или кошек, циклический гемопоэз, индуцированный ВЛК, иммуноопосредованная гипоплазия (при атаке на ранние предшественники).
• Мегакариоциты – селективная мегакариоцитарная гипоплазия (нечастое явление), иммуноопосредованная, вызванная действием препаратов (гипоплазия обычно генерализованная, может наблюдаться и подавление только мегакариоцитарного ростка), влияние лекарственных веществ (меклофенамовой кислота, фенилбутазона, триметоприм – сульфадиазина).

Форма выдачи результата: бланк содержит описание цитологического состава материала костного мозга, оценку морфологии и последовательности созревания клеточных элементов, подсчет миелоидно/эритроидного соотношения, заключение и комментарий, в котором сопоставляется картина клинической крови и костного мозга на момент исследования и указываются вероятные причины того или иного состояния.

Источники:

1. Bone marrow evaluation in dogs and cats, Wellman, Maxey L. Radin, M. Judith.; Ralston Purina Company, 1999;

2. Veterinary Hematology, A Diagnostic Guide and Color Atlas, By John W. Harvey, DVM, PhD, DACVP, 234-318;

3. Bone marrow cytologic and histologic biopsies: indications, technique, and evaluation, Raskin RE, Messick JB., Vet Clin North Am Small Anim Pract. 2012 Jan;42(1):23-42;

4. Collection and evaluation of bone marrow aspirates and core biopsies from dogs, COSMIN PEŞTEAN, ADRIAN TODOR, OANA FLORESCU and others, Annals of R.S.C.B., Vol. XXII, Issue 1, 2017, pp. 44 – 48;

5. Ш.Ваден,Д.Нолл, Ф. Смит, Л.Тиллей. Полное руководство по лабораторным и инструментальным исследованиям собак и кошек.