Выявление клональности лимфоцитов (PARR)

Выявление клональности лимфоцитов (PARR) применяется для диагностики лимфопролиферативных заболеваний. Тест на клональность может выявить одну неопластическую клетку на сто клеток, что дает возможность обнаружить неопластические лимфоциты раньше, чем цитологическое или гистологическое исследование.

Данное исследование на выявление клональности лимфоцитов чаще всего используется для различия реактивных/ поликлональных лимфоцитов от неопластических/ моноклональных, при не результативности ранее проведенных исследований. Диагностическая чувствительность и специфичность анализа клональности составляет около 85%. Ложноположительные результаты могут быть получены в случаях инфекции, вызванной Ehrlichia canis. Так же есть данные нескольких исследований в результате которых было показано о возможной клональной экспансии лимфоцитов при НЕ неопластическом заболевании (в исследовании выявлена ассоциация В-клеточной моноклональной экспании) у собак которая может быть связана с некоторыми кровопаразитарными заболеваниями, такими как боррелиоз (болезнь Лайма), бартонеллезом и пятнистой лихорадкой Скалистых Гор.

У каждого метода есть свои ограничения, что важно для его правильного применения.

Обнаруженная клональность не является синонимом злокачественности и не всегда означает наличие лимфомы. Крайне важно интерпретировать результаты молекулярных тестов в контексте всех имеющихся гистологических, клинических и иммуногистохимических данных. Необходимо тесное сотрудничество патолога с молекулярным биологом. Например, в одной из крупных работ исследовали В- и Т-клеточную клональность в материале 106 гистологически подтвержденных реактивных процессов. Действительно, 75% случаев оказались истинно поликлональными, для 15% образцов был получен сомнительный результат, но после их тщательного всестороннего исследования они также были признаны поликлональными [9]. Однако 10% образцов (12 пациентов) имели явную клональную природу. После их гистологического пересмотра выяснилось, что среди них действительно оказались две пропущенные лимфомы. Остальные 10 пациентов имели клональность при гистологически верифицированном доброкачественном процессе. Очевидно, с иммунологической точки зрения большинство реактивных процессов протекает с вовлечением многочисленных поликлональных лимфоцитов. Вместе с тем есть инфекционные заболевания (цитомегаловирусная инфекция, инфекция, вызванная вирусом Эпштейна—Барр, токсоплазмоз, туберкулез), а также особые воспалительные процессы (саркоидоз и др.), при которых организм может отвечать с помощью генетически ограниченного спектра клеток лимфоидного ряда. В настоящее время недостаточно выяснено, как эти активированные антигеном иммунные реакции проявляются на ДНК-уровне. Поэтому во всех случаях появления сомнительных и спорных результатов в первую очередь необходимо исключить технические ошибки и учесть патофизиологию протекающего процесса. Существуют также доброкачественные состояния с установленной клональной природой.

Клональность нельзя расценивать как прямой маркер линейности. Хотя в большинстве В-лимфом обнаруживается В-клеточная клональность, а в Т-лимфомах — Т-клеточная, существуют исключения и ограничения. В первую очередь нужно помнить о «нелегитимных» (перекрестных) перестройках, главным образом это касается B- и Т-лимфобластных лейкозов/лимфом у детей. Однако в лимфомах из зрелых лимфоцитов также обнаружены такие перекресты, хотя и в значительно меньшем проценте случаев. Так, около 10—20% B-клеточных лимфом несут перестройки TCR-генов, в свою очередь около 5—10% Т-лимфом содержат перестройки генов Ig [19]. Такие находки иногда связывают с присутствием сопутствующих клонов противоположной линейности. Существуют также нозологии, при которых перекрестные перестройки особенно часты: около 27% ангиоиммунобластных Т-клеточных лимфом имеют как В- так и Т-клональность, а в 5% случаев данного заболевания выявляется только В-клональность, что при недостаточно всестороннем анализе может привести к ложному диагнозу. В 24% случаев ALK+ и 11% случаев ALK– Т-клеточных лимфом Т-клеточная клональность не выявляется [1]. Все вышеперечисленное безусловно необходимо учитывать при постановке диагноза.

Псевдоклональность — обратная сторона высокой чувствительности ПЦР-методологии. При анализе мелких биоптатов с незначительным количеством лимфоцитов можно обнаружить ложную клональность. Следует избегать мелких тонкоигольных биоптатов или материала с незначительным количеством лимфоидных клеток. В этом случае возможно как обнаружение псевдоклональности, так и получение ложноотрицательного результата (отсутствие опухоли в образце). Другой пример появления псевдоклональных результатов — анализ реактивных лимфатических узлов с ограниченным репертуаром иммунного ответа, т.е. случаев, когда в узле идет выработка нескольких клонов клеток, например, в ответ на активно протекающую вирусную инфекцию. По этой же причине клональность можно обнаружить в материале, содержащем один крупный герминативный центр. Во всех случаях получения спорных результатов необходимо проводить повторные исследования в параллельных реакциях и консультацию с опытными коллегами, а не пытаться интерпретировать результат исходя из высоты пиков или площади, которую они занимают.

Ложноположительные результаты — преимущественно следствие ошибок в интерпретации полученных данных. Эта проблема во многом решена благодаря использованию современных методов детекции — ГД-анализа и GeneScanning. Ложноотрицательные результаты возможны при высокой степени мутаций в месте отжига праймеров, что приводит к отсутствию ПЦР. Этот феномен хорошо известен для лимфом, прошедших соматическую гипермутацию. Фолликулярная, В-диффузная крупноклеточная лимфома, лимфома из клеток маргинальной зоны, множественная миелома — вот перечень лимфом, представляющих наибольшую трудность в выявлении В-клональности при недостаточном количестве исследуемых локусов. Решение этой проблемы — использование, кроме полной V-D-J-перестройки, анализа комплементарных локусов (D-J и IgK), что значительно уменьшит число ложноотрицательных результатов.

Разработанный стандартизованный протокол BIOMED-2 лег в основу создания диагностических тест-систем для определения клональности В- и Т- лимфоцитов. Сегодня эти наборы коммерчески доступны — www.invivoscribe.com, а сам протокол стал мировым стандартом при диагностике клональности . Широкое распространение этой техники и относительная простота ее выполнения требуют контроля качества и обучения специалистов для правильного использования метода, снижения диагностических ошибок. С этой целью ежегодно проводится обучающий семинар для всех, кто начал использовать метод или имеет какие-либо затруднения — www.euroclonality.org. На этом же сайте можно получить ответы на часто задаваемые вопросы, а также проконсультироваться при сложных диагностических случаях с опытными коллегами.

На сегодняшний день молекулярно-генетическое исследование клональности B- и Т-лимфоцитов — высоконадежный метод комплексного анализа, который в контексте гистологических, клинических и иммуногистохимических данных эффективно помогает патологу поставить или подтвердить диагноз. Качество диагностики новообразований лимфоидной ткани существенно улучшается проведением анализа клональности лимфоцитов. Из большого количества маркеров клональности предпочтительнее анализировать состав антигенных рецепторов В- и Т-лимфоцитов, который формируется на ранних стадиях их созревания. Результатом этого многоступенчатого процесса является рекомбинация генов, кодирующих цепи иммуноглобулинов (Ig) и Т-клеточных рецепторов (ТКР). На конечной стадии такой перестройки формируется фрагмент ДНК, уникальный по длине и последовательности для каждой клетки. Поскольку количество подобных комбинаций оценивается величиной порядка 1012, крайне маловероятно, что идентичные рецепторы появляются у клеток из независимых линий.

Большая часть (>98%) злокачественных лимфом характеризуется наличием идентичных антигенраспознающих структур. Принимая во внимание, что все клетки лимфомы являются потомками одного предшественника, т.е. представляют собой клон, обнаружение клональности по результатам генной рекомбинации может улучшить диагностику лимфопролиферативных заболеваний.

Подготовка пациента: зависит от выбранного аналита для исследования.

Показания:

·       дифференцировки реактивных (поликлональных) лимфоцитов от неопластических (моноклональных),

·       обнаружения лимфопролиферативного заболевания (лимфомы, хронической лимфоидной лейкемии), если результаты цитологического или гистологического исследования не являются однозначными

·       ретроспективного поиска пренеопластических экспансий лимфоцитов.

·       дифференцировки Т- и В- лимфом

Противопоказания: неизвестны.

Метод отбора биоматериала: венепункция, ТИБ/ТИАБ, биопсия.

Преаналитика:

ВАЖНО! При заказе исследования из цельной крови необходимо приложить копию результата общего анализа крови. Допускаются в работу окрашенные стекла цитологические (не гистологические) с подтвержденный диагнозом «лимфома».

Порядок действий:

1.  Биоптат ткани: поместить в стерильный контейнер с красной крышкой заполненный 70% спиртом в соотношении ткань:спирт 1:10. Если биоптат размером до 0,5 см -  в качестве контейнера использовать эппендорф (наполнить 70% спиртом,    соотношение ткань:спирт то же). Плотно закрыть контейнер крышкой.  Если используется эппендорф - пробирку плотно закрыть крышкой до щелчка.

2. Аспиратов ткани: использовать пробирку с розовой крышкой (ЭДТА). Поместить аспират на дно пробирки.  Если срок хранения и транспортировки превышает 48 часов, материал замораживается в пробирке.

3. Цельная кровь и костный мозг: набрать биоматериал строго до отметки на этикетки пробирки с розовой крышкой (ЭДТА). Перевернуть пробирку 7-10 раз для перемешивания биоматериала с антикоагулянтом.

4. Плевральная, абдоминальная жидкости (подходят все типы выпотов, при условии, что они ассоциированы с лимфомой): набрать биоматериал строго до отметки на этикетки пробирки с сиреневой крышкой (ЭДТА). Перевернуть пробирку 7-10 раз для перемешивания биоматериала с антикоагулянтом.

5. Контейнер маркировать Ф.И.О. владельца, кличкой животного. Заполнить направительный бланк, указав код клиента.

6. Температурный режим транспортировки в лабораторию +2°С…+8°С (синий пакет). Для аспирата – если срок хранения превысил 48 часов, температурный режим транспортировки в лабораторию -17°С…-23°С (красный пакет).

Интерпретация результата: Результаты исследования содержат информацию исключительно для врачей. Диагноз ставится на основании комплексной оценки различных показателей, дополнительных сведений и зависит от методов диагностики.

Форма выдачи результата: качественный (установлено/не установлено наличие моноклональной популяции Т- и В-лимфоцитов) с комментарием.

Источники:

1)     «Sensitivity for the detection of a clonally rearranged antigen receptor gene in endoscopically obtained biopsy specimens from canine alimentary lymphoma» Kenjiro Fukushima 1, Koichi Ohno, Yuko Koshino-Goto, Kazuyuki Uchida, Kohji Nomura, Masashi Takahashi, Ko Nakashima, Yasuhito Fujino, Hajime Tsujimoto.

2)     PMID: 20046040 DOI: 10.1292/jvms.001673 или J Vet Med Sci. 2009 Dec;71(12):1673-6. doi: 10.1292/jvms.001673.

3)     «First-time application of a PCR-based clonality assay in a large cohort of non-domestic felines» Sophia Unterkreuter 1, Annika Posautz 2, Barbara C Rütgen 3, Sandra Groiss 1, Anna Kübber-Heiss 2, Sabine E Hammer 4.

4)     P Res Vet Sci. 2021 Mar; 135:511-516. doi: 10.1016/j.rvsc.2020.11.011. Epub 2020 Nov 19. «MID: 33243452 DOI: 10.1016/j.rvsc.2020.11.011.

5)     «Polymerase chain reaction for antigen receptor rearrangement: Benchmarking performance of a lymphoid clonality assay in diverse canine sample types» E. J. Ehrhart,Shukmei Wong,Keith Richter,Victoria Zismann,Carolyn Grimes,William Hendricks,Chand Khanna.

6)     First published: 02 April 2019 https://doi.org/10.1111/jvim.15485

7)     «Cross Lineage Rearrangement in Feline Enteropathy-Associated T-cell Lymphoma» C. Andrews, M. Operacz, R. Maes, .First Published July 27, 2015, Veterinary Pathology.

8)     « Anaplastic Large T-Cell Lymphoma in the Intestine of Dogs»Lauren W. Stranahan, Derick Whitley, Tuddow Thaiwong, Matti Kiupel, Fabiano Oliveira; First Published June 6, 2019 Veterinary Pathology.

9)     «Results of histopathology, immunohistochemistry, and molecular clonality testing of small intestinal biopsy specimens from clinically healthy client-owned cats» Sina Marsilio,Mark R. Ackermann,Jonathan A. Lidbury,Jan S. Suchodolski,Jörg M. Steiner ; February 2019.