Вирусная лейкемия (FeLV, обнаружение провирусной ДНК) (ПЦР)

Вирус лейкоза кошачьих (Feline leukemia virus, FeLV) – это Y-ретровирус (семейство Retroviridae) с сложной трехслойной структурой, непосредственно влияющей на формирование иммунного ответа хозяина.

Инфекция носит хронический характер с длительной бессимптомной фазой, при которой у кошек отсутствуют клинические признаки. Смертность от вируса животных, ведущих скученный образ жизни, оценивается в 50% на протяжении 2 лет, еще через год эта цифра может увеличиться до 80%.

Клинические проявления заболевания включают в себя изменения формулы крови, такие как анемия (нерегенеративная или регенеративная), персистирующая, преходящая или циклическая нейтропения, аномалии тромбоцитов (аномалии тромбоцитопении и функции тромбоцитов), апластическая анемия (панцитопения) и панлейкопение-подобный синдром.

Вирус FeLV основной онкоген, вызывающий различные опухоли у кошек, чаще всего лимфому и лейкоз, реже встречаются гематопоэтические опухоли и другие злокачественные новообразования (включая нейробластому, остеохондрому). При заражении вирусом лейкоза у животных развивается миелосупрессия и другие гематопоэтические нарушения. Лимфомы и лимфоцитарная инфильтрация в головном или спинном мозге приводят к компрессии. Наиболее клинически важным последствием инфекции считается иммуносупрессия, которая может приводить к вторичным инфекционным заболеваниям, определяющим большинство клинических признаков и к снижению механизмов влияния на опухоль. Вторичные заболевания у кошек, инфицированных FeLV, поддаются лечению.

После заражения вирус размножается в лимфоидной ткани ротоглотки. Репликация вируса может быть прекращена у иммунокомпетентных кошек, в крови которых присутствует высокий уровень нейтрализующих антител. В крови таких животных вирус не обнаруживается. Однако даже в случае эффективного иммунного ответа возможно развитие болезни, при котором после начального инфицирования реплицирующийся вирус посредством мононуклеарных клеток (лимфоциты и моноциты) распространяется в организме. Такие кошки дают положительный ответ в ИФА (ELISA) и ПЦР, так как в плазме крови содержится вирус. На этой стадии заболевания животные выделяют вирус со слюной, однако у таких животных, благодаря адекватному иммунному ответу, инфекция спустя несколько недель или месяцев прекращается. Важно понимать, что результатом этого сценария будет инфицирование клеток костного мозга провирусной ДНК (срок 3 недели), что в последствии приведет к выработке инфицированных гранулоцитов и тромбоцитов, циркулирующих в организме. Массированная виремия может быть остановлена организмом, но полного выведения вируса из организма произойти не может, так как провирусная ДНК находится в стволовых клетках костного мозга (регрессирующая форма). В этом состоянии вирус активно не размножается, все исследования, направленные на выявление антигена вируса, будут давать отрицательный результат. Такие кошки не заразны, так как вирус не выделяют. Выявить таких животных возможно при проведении анализа крови с использованием ПЦР, направленной на детекцию провирусной ДНК.  Эта форма инфекции может быть реактивирована, например, после иммуносупрессии.

В организме животных с ослабленным иммунитетом происходит размножение вируса (прогрессирующая форма). В первую очередь вирус заселяет лимфоидные ткани, затем костный мозг и эпителиальные ткани слизистой оболочки и желез. Зараженные кошки постоянно представляют опасность для своих сородичей всю оставшуюся жизнь. У кошек с этой формой инфекции развиваются болезни, связанные с FeLV. Подавляющее большинство из них умрет в течение нескольких лет.

Выявить больных животных можно с использованием повторных тестирований после начальной стадии заболевания на наличие вирусного антигена в крови. При регрессирующей форме заболевания антигены в крови и, соответственно, сам вирус будут выявляться в течение 16 недель с момента заражения. Кошки с прогрессирующей формой останутся всегда положительными.  Первоначально и регрессивная и прогрессивная формы инфекции сопровождаются персистирующей провирусной ДНК вируса в крови, обнаруживаемой с помощью ПЦР. Более позднее протекание заболевания в случае регрессивной формы будет сопровождаться низкой вирусной нагрузкой, прогрессирующая форма будет характеризоваться высоким содержанием вируса в организме кошки. Это возможно выявить с использованием рт-ПЦР.

Исследуемый аналит: костный мозг.

Подготовка пациента: общая анестезия не обязательна. Необходимо ввести седативные препараты, оказывающие также слабый или умеренный   обезболивающий эффект.

Показания: заболевшие животные, особенно с анемией, лимфомой, поражением костного мозга или полиартритом.

Противопоказания:

• коагулопатия;
• выраженная тромбоцитопения.

Метод отбора биоматериала: пункция костного мозга.

Места взятия:

• проксимальный эпифиз плечевой кости (чаще всего, особенно при общей анестезии)
• проксимальный эпифиз бедренной кости
• гребень подвздошной кости (используется редко).

Способ взятия биоматериала:

• асептическая подготовка места вкола (выбрить шерсть, обработать спиртом);
• дополнительно местно обезболить, несмотря на уже имеющуюся общую/местную анестезию (1% лидокаин, 2% новокаин), послойно («лимонная корка»), включая надкостницу;
• выждать 1-2 мин.;
• небольшой надрез кожи 1 см.;
• ввести иглу до надкостницы, далее крутить до провала, т.е. до прохода иглы через кортикальный слой кости;
• подсоединить шприц к игле и насосать ККМ (примерно 1 мл, больше не стоит, чем сильнее насасывать, тем больше гемодилюция);
• СРАЗУ перелить пунктат в пробирку с ЭДТА, хорошо перемешать.

1. Провести процедуру взятия костного мозга (КМ).
2. Перенести полученную жидкость в пробирку с сиреневой крышкой (ЭДТА).
3. После внесения жидкости, осторожно перевернуть пробирку 6-7 раз для перемешивания материала с антикоагулянтом.
4. Заморозить в вертикальном положении при -17°С…-23°С.
5. Пробирку маркировать Ф.И.О. владельца и кличкой животного, указать локализацию.
6. Заполнить направительный бланк, указав код клиента. 
7. Температурный режим транспортировки в лабораторию -17℃…-23℃ (красный пакет)

МИНИМАЛЬНЫЙ ОБЪЕМ КОСТНОГО МОЗГА ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ 1 МЛ

Интерпретация: результаты исследования содержат информацию исключительно для врачей. Диагноз ставится на основании комплексной оценки различных показателей, дополнительных сведений и зависит от методов диагностики. 

Результаты анализа должны интерпретироваться в свете состояния здоровья обследуемой кошки, а для подтверждения ВЛК-статуса у животного может потребоваться повторное обследование или использование альтернативного метода исследования. ВЛК- инфицированная кошка может оставаться бессимптомным носителем инфекции в течение многих лет, хотя 85 % животных погибают в течение 3 лет. Положительный результат обследования не должен становиться единственным критерием при принятии решения об эвтаназии.

Положительный результат ПЦР на провирусную ДНК указывает на присутствие провируса ВЛК в пробе, что возникает при виремии (преходящей или постоянной), а также при латентной инфекции и при выздоровлении (при этом результаты анализов ИХА и ИФА будут отрицательными).

Форма выдачи результата: качественный метод.

Результат исследования: обнаружение или не обнаружение в исследуемой пробе провирусной ДНК Feline leukemia virus, FeLV.

Использованная литература:

1. O'Connor, T.P. Jr.; Tonelli, Q.J.; Scarlett, J.M. Report of the national felv/fiv awareness project. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1991, 199, 1348-1353.

2. Levy, J.K.; Scott, H.M.; Lachtara, J.L.; Crawford, P.C. Seroprevalence of feline leukemia virus and feline immunodeficiency virus infection among cats in north america and risk factors for seropositivity. J Am Vet Med Assoc 2006, 228, 371-376.

3. Hoover, E.A.; Mullins, J.I. Feline leukemia-virus infection and diseases. Journal of the American Veterinary Medical Association 1991, 199, 1287-1297.